小鼠 CiPS 细胞的诱导
诱导的核心在于利用小分子化合物协同调控细胞信号通路和表观遗传修饰，从而替代外源主效基因如Oct4的作用，逐步建立内源多能性网络。
重编程过程分为两个关键阶段，早期阶段和晚期阶段。早期阶段即去分化与XEN样状态，小分子组合如CHIR、616452、FSK能够显著上调内源多能性相关基因Sall4和Sox2，并激活胚外内胚层（XEN）标志基因Gata4、Gata6、Sox17。Sall4与这些XEN基因形成正反馈网络，这一过程类似于两栖动物肢体再生中由Sall4介导的早期去分化过程。
晚期阶段解锁多能性核心基因，在体细胞中，Oct4启动子被高度甲基化而沉默。表观遗传调节剂DZNep的加入，能够显著降低Oct4启动子的DNA甲基化和H3K9甲基化水平，从而激活 Oct4 的表达。随后，Oct4和Sox2共同激活下游多能性网络，并抑制GSK3和MAPK信号下完成重编程，激活Nanog并沉默Gata6。
具体方法是利用起始细胞即小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、新生鼠成纤维细胞（MNFs）或成体脂肪干细胞（ADSCs）和核心小分子组合VC6TFZ：VPA (V)、CHIR99021 (C)、616452 (6)、Tranylcypromine (T)、Forskolin (F)、DZNep (Z)。后续优化加入合成视黄酸受体配体作为增强剂，可将效率提升40倍，最高达到0.2%。诱导流程是第0-16/20天使用 VC6TF 培养基处理细胞，诱导细胞发生间充质-上皮转化，形成表达E-cadherin的致密、上皮样细胞簇。第16/20-28天加入 DZNep形成VC6TFZ组合，促进 Oct4 等基因表达，形成边缘不清晰的GFP阳性或内源多能标记阳性克隆。第28天以后将细胞转移至2i-培养基中。在双重激酶抑制的作用下，克隆发育为典型的ESC样形态，即小鼠CiPS细胞。
人 CiPS 细胞的诱导
人类体细胞具有比小鼠更稳定的表观基因组和更低的可塑性，对化学刺激具有极强的屏障作用。因此，人CiPS细胞诱导的核心原理是通过化学小分子强行创造一个中间可塑状态，模拟低等动物如墨西哥钝口螈肢体再生时的去分化过程。
诱导的早期阶段是诱导中间可塑状态，通过小分子组合破坏成纤维细胞特性，诱导细胞进入去分化状态。这一阶段激活了一个类似于肢体再生的基因调控网络包括LIN28A、SALL4、MSX1、MSX2、HOXB9 等发育和再生相关基因。
研究发现JNK通路是阻碍人类细胞获得可塑性的主要屏障。使用JNK抑制剂能够抑制TNF和IL-1等促炎通路的激活，从而允许细胞进入开放染色质状态并获得可塑性。
中晚期阶段是XEN样状态过渡与多能性建立，可塑态细胞随后过渡到表达SOX17、HNF1B等基因的XEN样状态。OCT4+细胞正是从这些XEN样克隆内部出来的。在特定信号抑制剂和表观遗传调节剂的共同作用下，细胞激活内源OCT4、SOX2、NANOG网络，经历一个短暂的多能性阶段，最终在培养体系中稳定为始发态的人CiPS细胞。
具体方法是利用起始细胞即人胚胎成纤维细胞、人成体脂肪间充质干细胞或人成体真皮成纤维细胞。在8-12天利用CHIR99021, 616452, TTNPB, Y27632, ABT869, SAG下调成纤维细胞基因，上调上皮基因和 LIN28A，使细胞转变为单层上皮样细胞。16-20天时，加入表观遗传调节剂和至关重要的JNKIN8诱导全基因组低甲基化，激活SALL4等再生相关基因，形成多层细胞克隆。8-12天利用CHIR99021、616452、Y27632、PD0325901、Tranylcypromine、VPA、DZNep、EPZ004777、UNC0379等，诱导XEN样克隆形成，并从克隆内部激活OCT4表达。7-10天时利用CHIR99021、Y27632、PD0325901、IWP-2、SB590885促使细胞共表达OCT4、SOX2、NANOG，形成致密的人多能干细胞样克隆。
将Stage IV长出的初级克隆消化后，接种于饲养层或Matrigel上，使用 mTeSR Plus 培养基 进行长期维持和扩增，最终获得稳定的人CiPS细胞系。
参考文献：
- Hou P, Li Y, Zhang X, et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds[J]. Science, 2013, 341(6146): 651-654.
- Guan J, Wang G, Wang J, et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells[J]. Nature, 2022, 605(7909): 325-331.