Baltimore病毒分类系统以病毒基因组及其转录mRNA的方式为标准,将病毒分为双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒、正义单链RNA病毒、负义单链RNA病毒、单链RNA逆转录病毒和双链DNA逆转录病毒等七类。
实验一:确定遗传物质是DNA还是RNA
为了确定诺如病毒的Baltimore类型,我们需要先确定诺如病毒的遗传物质是DNA还是RNA。
利用DNA和RNA对不同核酸酶的敏感性不同。DNase可以特异性降解DNA,对RNA基本没有作用。而RNase可以降解RNA,对DNA基本没有作用。因此,把病毒核酸分别用DNase和RNase处理,再检测核酸是否还存在,就可以判断其类型。
第一步提取病毒核酸。取病毒样品,加入核酸提取试剂盒中的裂解液。将裂解后的样品加入硅胶膜柱或磁珠等核酸纯化体系。使用核酸提取试剂盒中的洗涤液对结合的核酸进行洗涤,以去除蛋白质、残留裂解液等可能影响后续酶反应的其他杂质。加入洗脱液使结合在固相材料上的核酸释放。收集洗脱液,得到病毒核酸提取物,测定核酸浓度和纯度。
第二步。设置A、B、C三组。A组不加入核酸酶,进行相应的缓冲液处理,证明原始样品中确实存在可检测的核酸。B组加入DNase,在适宜的反应条件下处理。C组加入RNase,在适宜的反应条件下处理。
第三步,采用核酸电泳等检测方法分别检测A、B、C三组中的核酸信号。
预期结果是A组:有核酸信号;B组仍然存在核酸信号;C组核酸信号消失或显著降低。
预期结果说明DNase不能有效破坏诺如病毒核酸,而RNase能够破坏诺如病毒核酸。结论是诺如病毒的遗传物质是RNA,而不是DNA。可排除诺如病毒是双链DNA病毒、单链DNA病毒和双链DNA逆转录病毒。
实验二:确定RNA是单链还是双链
RNA分子中存在单链区域和碱基配对形成的双链区域。一些核酸酶对这些结构具有不同的偏好,例如RNase S1等主要识别单链区域,RNase A可以切割某些暴露的单链RNA区域而RNase V1偏好双链或碱基配对区域。
第一步。设置A、B、C三组。A组不进行任何特殊处理,仅作为阳性对照。B组使用RNase A处理,如果病毒RNA中存在大量暴露的单链区域,会出现相应的切割。但由于RNase A并不是绝对的“ssRNA专一酶”,且RNA的二级结构会影响酶的可及性,dsRNA在某些条件下也可能受到作用。并且一个病毒基因组可能有大量局部二级结构。我们设置C组使用RNase V1进行处理,RNase V1偏好RNA中的碱基配对区域,如果存在会出现切割,进一步确定诺如病毒RNA是单链或是双链。
第二步,采用核酸电泳等检测方法分别检测A、B、C三组中的核酸分段信号。
预期结果是B组电泳条带最多,条带分散最明显。
预期结果说明诺如病毒核酸主要可与RNase A反应。结论是诺如病毒的遗传物质是单链RNA。可排除诺如病毒是双链RNA病毒。
实验三:判断是正链RNA还是负链RNA
我们可以通过检测病毒RNA本身是否具有直接翻译能力来判断正链还是负链,我利用标记氨基酸掺入法检测翻译过程中新合成的蛋白。
第一步,配置无细胞翻译体系,其中换用可检测的荧光标记氨基酸。
第二步,设置A、B、C、D四组。A组加入诺如病毒RNA和无细胞翻译体系作为实验组。B组仅加入无细胞翻译体系作为阴性对照。C组加入经RNA酶处理的诺如病毒RNA和无细胞翻译体系。D组加入已知可直接翻译的正链RNA和无细胞翻译体系作为阳性对照。
第三步,分别用激光激发A、B、C、D四组的荧光信号,检测荧光强度。
预期结果是A组有明显强信号,C组信号相较于其他三组明显降低。
预期结果说明诺如病毒RNA确实翻译出了新蛋白。结论是诺如病毒的遗传物质是正链RNA。可排除诺如病毒是负义单链RNA病毒。
实验四:判断是否为RNA逆转录病毒
我们试图检测诺如病毒的复制过程中是否存在病毒来源的DNA中间体。
第一步,对先前获取的RNA进行测序,设计引物。
第二步,将病毒样品利用DNase进行处理,去除原有游离DNA。
第三步,利用引物对去除游离DNA的病毒样品进行DNA-PCR。
第四步,利用核酸电泳进行检测。
预期结果没有条带。
预期结果说明没有产生DNA中间体。结论是诺如病毒不是RNA逆转录病毒。